Blood|全面且深度解读如何利用NGS MRD改善ALL风险分层和预防复发
发布时间：2024-06-20 10:47 | 点击次数：1798
高通量的二代测序（NGS）技术用于急性淋巴细胞白血病（ALL）患者微小残留病（MRD）检测灵敏度可达10-6，比流式MRD检测方法更能准确评估治疗效果，预测复发和生存结局，这已得到众多研究证实。但由于众多临床医生或从业人员对NGS MRD的结果解读理解有限，使得其在全球范围内的普及应用仍有很大挑战。
Michael A. Pulsipher教授等人2024年5月10日在Blood杂志发表了一篇文章，通过典型病例回顾结合相关研究讨论和专家意见的方式，分享了其在儿童和成人ALL患者造血干细胞移植（HCT）前后应用NGS-MRD检测方法的经验，详细介绍了NGS MRD方法应用的细节事项，并针对临床应用中的问题提供了合理化建议，值得大家参考。
病例回顾
一名20岁女性B-ALL患者，诊断时的骨髓穿刺样本通过NGS MRD检测鉴定出2个显著性克隆序列，分别是序列A-IGH和序列B-IGK。在化疗诱导治疗后达到形态学完全缓解（CR），流式（MFC）MRD结果为0.8%，巩固治疗后增至6%。然后患者接受CD19 CAR-T细胞治疗，形态学和流式检测实现了CR，但在CAR-T细胞输注3个月后NGS MRD结果为阳性，每百万有核细胞中检测到2个序列A (IgH)的克隆细胞和5个序列B (IgK)的克隆细胞。实验室检测结果显示患者CD19计数为80个细胞/μL。建议进行巩固性同种异体 HCT。
患者接受全身照射(TBI)和氟达拉滨的清髓性预处理后进行同种异体HCT，然后药物预防移植物抗宿主病(GVHD)。HCT后28天复查骨髓，显示CR伴MFC和NGS MRD阴性。
在HCT后60天，患者发生皮肤II期急性GVHD，局部类固醇治疗后缓解。HCT后90天骨髓NGS-MRD检测，序列A (IgH)检测不到 (检出限LOD <1/100万个有核细胞)，但检测到序列B (IgK) <1/100万个有核细胞(LOD 47/100万个有核细胞)。1个月后复查NGS-MRD为阴性。HCT后6、9和12个月送检骨髓NGS-MRD检测，结果均为阴性。在HCT后的第二年，每2-3个月监测一次外周血NGS-MRD，结果仍为阴性。
结合这个病例，作者围绕NGS-MRD检测的常见问题进行了解答和探讨，比如HCT前MRD检测的考虑因素、如何根据检测结果调整治疗方案、对结果的解读、HCT后监测样本的选择等。
HCT前NGS-MRD检测的临床考虑因素
如上述案例所示，CAR-T细胞治疗后NGS-MRD阳性与临床复发风险增加显著相关，有研究评价了CAR-T细胞治疗后NGS-MRD阴性缓解儿童进行HCT以巩固疗效的作用，有数据表明，在一些持续阴性的NGS-MRD患者中可以避免HCT。在成人 ALL患者中用HCT来巩固CAR-T细胞作用仍然是一个争议的领域，但作者目前的做法是如果未移植的成人ALL患者在接受 CAR-T细胞疗法后出现NGS-MRD阴性CR，但不能长期维持，则会考虑对其进行巩固性HCT。
一般来说，在HCT之前应尽量清除NGS-MRD。多项研究表明，在HCT之前，通过NGS检测到任何水平MRD都可以预测HCT后复发风险增加和生存期较差。这在ASCT0431研究中对儿童和青少年的分析中得到证明，其中HCT前NGS-MRD阳性患者的两年复发率为53%，而NGS-MRD阴性患者复发率为0(图1A)。与HCT前的MFC-MRD相比，NGS-MRD提高了对HCT后复发和总生存期(OS)预测的准确性。在成人ALL患者中也有类似发现，任何水平的HCT前NGS-MRD阳性结果均与不良移植结局相关(图1B)。
图1
但是HCT前深度清除MRD的目标必须与其他实际因素(如供者选择、药物毒性等)进行权衡。如果无法清除NGS-MRD且患者适合HCT，建议继续进行HCT。因为有研究表明，对于HCT前NGS-MRD为阳性（MFC为阴性）的儿童和青少年，至少半数仍可长期无病生存。
基于NGS-MRD调整HCT前后治疗方案
围HCT期NGS-MRD结果可在一定程度上指导移植预处理、GVHD预防和HCT后维持治疗方案（图2）。回顾性数据显示，HCT前的NGS-MRD可以区分需要清髓性TBI的患者和可以安全忽略TBI的患者，以使部分患者避免TBI的毒副作用。有研究发现，HCT前NGS-MRD阴性患者在TBI或非TBI治疗后的预后同样优异，对于这部分患者清髓性TBI或可被忽略。但迄今为止尚缺乏结论性随机研究。
图2
HCT后持续或新出现NGS-MRD阳性可能提示即将临床复发，预示预后不良。在HCT后首次检测到NGS-MRD阳性和临床复发之间存在大约3-6个月的干预“窗口期”。由于急性GVHD的发生与B或T-ALL复发呈反比关系，HCT后早期减少或撤销免疫抑制以诱导移植物抗白血病(GVL)是一种有价值的策略。有研究发现，在HCT后MRD阳性患者中，与未发生GVHD的患者相比，发生急性GVHD的患者复发风险较低、EFS较高。然而，只有I-III级急性GVHD的儿童患者获得临床效益，因为IV级急性GVHD患者复发风险降低的效益被移植相关死亡率增加的风险所抵消。
NGS-MRD结果解读的注意事项
正确解读NGS-MRD报告结果对于临床决策十分重要。部分患者可能检测到不同链的多个显著性克隆，要注意显著性克隆序列的检出限（LOD），因为较高的LOD产生非特异性信号的风险有所增加。由于重链IGH相对于轻链具有更大的多样性和独特性，因此轻链往往具有更高的LOD。鉴定的显著性克隆序列中，大约有60%具有高度独特性，而有20%的序列不那么独特，更有可能是背景克隆。样品中有核细胞数量也会影响LOD，有核细胞数量少时LOD偏高。
虽然不太独特的序列可能是非肿瘤细胞的克隆扩增，但当其具有低LOD时，这种不太独特的序列很可能代表肿瘤细胞，不应被忽视。
回到上面的病例，患者在HCT后90天骨髓NGS-MRD检测，未检测到序列A（IGH），但检测到序列B (IgK) <1/100万个有核细胞，但其LOD为47/100万个有核细胞。这种情况下，IGH的清零更可能代表肿瘤细胞的清除。有研究表明，在没有检测到IgH显著性克隆序列的情况下，MRD检测到不太敏感的IgK和IgL克隆序列与临床复发无关。
治疗过程中新出现的显著性克隆应该在患者临床病程背景下进行解释，它们在目前的研究中未与复发密切相关，可能是非肿瘤性克隆扩增。因此在临床实践中应用NGS-MRD时，要纳入所有临床数据：显著性克隆所属链和LOD、序列随时间的跟踪变化情况、样品中的序列丰度等，综合考虑以更好地理解NGS MRD结果。
HCT后NGS-MRD监测
HCT后长期监测NGS-MRD可以为MRD阳性患者提早发出警报，以提供早期干预的机会。作者建议对Ph阴性B-ALL患者进行约2年的HCT后NGS-MRD监测，对Ph阳性B-ALL患者建议监测5年。
有一些研究支持使用外周血作为骨髓穿刺的替代进行NGS-MRD监测，在配对的血液和骨髓样本中观察到NGS-MRD的良好一致性。还有研究发现，使用骨髓进行NGS-MRD检测比使用血液的灵敏度高约1-2倍。但即便如此，血液的NGS-MRD评估也至少与骨髓的MFC一样敏感。所以部分专家推荐采用外周血代替骨髓作为HCT后NGS-MRD监测的样本来源。
Ph+ALL患者的NGS-MRD检测
多项研究表明，在Ph+ B-ALL患者中，NGS-MRD和定量PCR检测的BCR::ABL1之间存在不一致。在NGS-MRD阴性时，通过PCR持续检测到的BCR::ABL1+ B-ALL-M亚型与不良预后无关。而与之相反的是，无论BCR::ABL1 PCR结果如何，NGS-MRD都能预测Ph+ B-ALL的预后。所以作者建议在考虑对BCR::ABL1 PCR阳性进行干预之前，用NGS-MRD检测来确认结果。
总结
NGS MRD在HCT前后均可提供有价值信息，可用于指导临床决策。在接受非HCT治疗的ALL患者中，NGS-MRD检测也很重要，对评估治疗效果、预测复发和指导治疗方面均具有重要意义。专业人员正确解读NGS-MRD结果能够更好地指导临床决策，更有利于NGS MRD技术的推广和发展。
参考文献
Muffly L, Liang EC, Dolan JG, Pulsipher MA. How I Use Next Generation Sequencing-MRD to Plan Approach and Prevent Relapse after HCT for Children and Adults with ALL. Blood. 2024 May 10:blood.2023023699. doi: 10.1182/blood.2023023699.
Seq-MRD®相关认证及荣誉
1.获得欧盟CE资质认证
Seq-MRD®获得欧盟CE资质（注册号：DE/CA20/01-IVD-Luxuslebenswelt-190/22），获批的是人淋巴B细胞微小残留病基因检测试剂盒（可逆末端终止测序法）。
2.获得三项发明专利
艾沐蒽推出的Seq-MRD®血液癌症MRD检测是最早批实现商业化的产品，自2016年研发专利技术至今，艾沐蒽Seq-MRD®已经获得3项国家发明专利：
[1]“一种应用于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的引物组合及试剂盒”（专 利 号: 2016 11204857.0，授权公告号:CN 106957906 B）
[2]“一种检测微小残留病MRD的试剂盒”（专 利 号: 2018 1 1550133.0，授权公告号: CN 109652518 B）
[3]“一种检测微小残留病MRD的方法”（专 利 号: 2018 1 1549203.0，授权公告号: CN 109680062 B）
3.获得相关软件著作
艾沐蒽拥有自主研发的生信分析平台，艾沐蒽Seq-MRD® 已经获得3项国家计算机软件著作：
[1]“免疫组库MRD检测自动化报告系统[简称ImmuReport] V1.0”（登记号：2019SR0916207）
[2]“Seq-MRD检测自动化分析系统（DiscTermite）[简称：DiscTermite]0.4.6“（登记号：2019SR1131517）
[3]“基于免疫组库二代测序的微小残留病（MRD）检测数据处理系统”（登记号：2020SR0507594）
4.获得ISO双标体系认证
艾沐蒽生物成功通过ISO27001信息安全管理体系认证和ISO9001质量管理体系认证。
5.获得荣誉证书
艾沐蒽申报的“免疫组TCR/Ig高通量测序技术/血液肿瘤微小残留病（MRD）检测/Seq-MRD®”因其创新性、前沿性、市场实用性荣获“2022年度CCTB中国肿瘤标志物产业创新大会创新技术/产品评选”项目二等奖。
6.获批IVD一类证
2023年获批了【全血/骨髓基因组DNA提取试剂盒】（离心吸附柱法）备案编号：浙杭械备20230798 ，试剂盒分别适用于人外周血、骨髓样本的核酸的提取。
发表相关文献
Seq-MRD®发表相关文献
1、Huang Y, Zhao H, Shao M, Zhou L, Li X, Wei G, Wu W, Cui J, Chang AH, Sun T, Hu Y, Huang H. Predictive value of next-generation sequencing-based minimal residual disease after CAR-T cell therapy. Bone Marrow Transplant. 2022 Jun 1. doi: 10.1038/s41409-022-01699-2. Epub ahead of print. PMID: 35650329.（点击链接可查看文章内容）
2、Chen H, Gu M, Liang J, Song H, Zhang J, Xu W, Zhao F, Shen D, Shen H, Liao C, Tang Y, Xu X. Minimal residual disease detection by next-generation sequencing of different immunoglobulin gene rearrangements in pediatric B-ALL. Nat Commun. 2023 Nov 17;14(1):7468. doi: 10.1038/s41467-023-43171-9. （点击链接可查看文章内容）
3、Min'er Gu,Yahong Xia, Jingying Zhang, Yongmin Tang, Weiqun Xu, Hua Song Xiaojun Xu. The effectiveness of blinatumomab in clearing measurable residual disease in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia patients detected by next-generation sequencing. Cancer Med. 2023 Dec;12(24):21978-21984. doi:10.1002/cam4.6771.
获得国际市场认可
2023年DelveInsight公司发布的MRD国际市场研究报告中，艾沐蒽/Seq-MRD®是中国独一一家公司/产品进入国际调研市场报告。DelveInsight是一家位于前列的医疗保健市场研究和商业咨询公司，以其现成的联合市场研究报告以及为医疗保健行业的公司提供的定制解决方案而闻名。
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